【正文】  摘 要：巴斯德毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)是一种广泛使用的外源基因真核表达系统，该系统具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点，且对表达产物进行翻译后的修饰和加工，使得表达产物的理化性质更接近于天然蛋白，这是原核表达系统所不具备的。本文综述了巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及其应用现状。
  关键词：巴斯德毕赤酵母；真核表达；应用
  1宿主菌株
　　巴斯德毕赤酵母表达系统是20世纪80-90年代开发的一种真核高效表达系统。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，可以在以甲醇为唯一碳源的培养基上快速生长。甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶（AOX）、二羟丙酮合成酶(DHAS)和过氧化氢酶(catalase)，表达的AOX和DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的60-80%。而以葡萄糖、甘油或乙醇为碳源时，AOX几乎不表达[2]。AOX的合成是在转录水平调控的，其基因启动子为诱导型。
　　巴斯德毕赤酵母表达宿主菌是通过野生型石油酵母Y11430进行突变改造而来的，为了方便转化外源基因后筛选重组菌株，在组氨酸脱氢酶基因处有一突变。目前最为流行的毕赤酵母宿主菌为GS115 ，其含有AOX 1和AOX 2两个醇氧化酶基因，可以在含有甲醇的培养基上快速生长。KM71与GS115的区别在于只含有AOX 2基因，虽然AOX 2与AOX 1有97%的同源性[3]，但其甲醇代谢速度慢，因而在含有甲醇的培养基上生长速度低于后者。MC100-3同时缺失AOX 1和AOX 2基因，不能在含有甲醇的培养基上生长。在以上3种毕赤酵母宿主菌的基础上进一步改造，目前已得到有几十种不同的基因型的衍生宿主菌，例如几种蛋白酶缺失宿主菌，如SMD1163、SMD1165、SMD1168，这些宿主菌在用于外源蛋白的表达中，可尽可能的减少自身产生的蛋白酶对目的蛋白的破坏，减少表达外源蛋白的降解[1]。
  2表达载体
　　Invitrogen公司构建有多种巴斯德毕赤酵母表达载体，分为胞内表达型和分泌表达型。分泌型表达载体主要有pPIC9，pPIC9K[7]，pHIL-S1，pPICZa，pYAM75P6[8]；胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815[9]，pPIC3K[7]，pPICZ[8]，pHWO10[6]， pGAPZ，pGAPZa等。
　　用于转化酵母宿主细胞的表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。它是由来自酵母的部分基因序列和细菌的部分基因序列所组成。表达载体由许多元件构成，包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点，对分泌型载体还需要信号肽序列。
　　最常用的启动子是AOX启动子，分为两种，AOX 1和AOX 2，启动能力AOX 1明显高于AOX 2[5]。细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由A0X 1提供的。当以甲醇为唯一的生长碳源时，AOX 基因的表达被甲醇严格调控，并被诱导到相当高的水平，可占整个细胞可溶蛋白的30%以上。当AOX 1基因缺乏而只存在AOX 2时，大部分乙醇氧化酶的活力丧失，细胞利用甲醇能力降低。因此细胞在甲醇介质上生长很慢，这种菌株被称为Muts；AOX 1基因存在时，细胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快，这种菌株表型被称为Mut+。fld 1启动子也是强启动子，能在以甲醇为惟一碳源或以甲胺为惟一氮源(葡萄糖、甘油等为碳源)条件下表达[4]。另外在巴斯德毕赤酵母中克隆到一种组成型启动子，即三磷酸甘油醛脱氢酶启动子，在它控制下的β-Lacz基因表达率比甲醇诱导的AOX1启动子的产量更高[6]。由于该组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺更为简单，产量高，因而该启动子在今后的应用中较有潜力。
　　营养缺陷型受体菌常用HIS4标记。AMP（氨苄抗性基因），该抗性基因用于“穿梭”质粒转化大肠杆菌后，阳性重组子的筛选。G418抗性标记用于酵母重组子的筛选，通常阳性重组子对G418的耐受性越高，目的基因在宿主基因组中拷贝数越高。Zeocin也是选择性标记，不同点是其在大肠杆菌宿主和毕赤酵母宿主中都可以表达，但是，Zeocin是一种强诱变剂，可能导致转化子发生突变。
  3表达载体的整合与毕赤酵母
　　表达载体在线性化之后，与毕赤酵母基因组的整合方式可分为两种，一种在His或5’AOX 1的单酶切位点将质粒载体线性化，通过单交换整合进染色体，即插入外源基因后AOX 1基因仍然保留，这样得到的转化子表型为Mut+表型；另一种是双交换，外源基因通过重组替换了染色体上的AOX 1基因，造成AOX 1缺失，得到的转化子只有AOX 2基因，表型为Muts。这类重组子代谢甲醇的速度较低。
  4影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素
　　影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素很多，它不仅受目的基因的特性、基因剂量、整合位点、mRNA 5 和3 非翻译区(UTR)、cDNA的(A+T)含量、翻译起始区和信号肽等上游因素的影响，也受宿主菌、Mut(甲醇利用)表型、蛋白酶、蛋白加工、酶切和糖基化及培养条件的影响[10]。
　　外源蛋白表达量的高低很大程度上由外源基因自身决定，是影响外源基因表达成败的首要因素。巴斯德毕赤酵母表达过程中对氨基酸密码子具有偏好性，实际操中通常对某些碱基进行定点突变，将相对于毕赤酵母的稀有密码子替换成为宿主菌偏好的同义密码子。  巴斯德毕赤酵母密码子使用频率如下：       
  UUU 24.1(1963)   UCU 24.4(1983)   UAU 16.0(1300)   UGU  7.7( 626)
  UUC 20.6(1675)   UCC 16.5(1344)   UAC 18.1(1473)   UGC  4.4( 356)
  UUA 15.6(1265)   UCA 15.2(1234)   UAA  0.8(  69)   UGA  0.3(  27)
  UUG 31.5(2562)   UCG  7.4( 598)   UAG  0.5(  40)   UGG 10.3( 834)
CUU 15.9(1289)   CCU 15.8(1282)   CAU 11.8( 960)   CGU  6.9( 564)
  CUC  7.6( 620)   CCC  6.8( 553)   CAC  9.1( 737)   CGC 2.2( 175)
CUA 10.7( 873)   CCA 18.9(1540)   CAA 25.4(2069)   CGA  4.2( 340)
CUG 14.9(1215)   CCG  3.9( 320)   CAG 16.3(1323)   CGG  1.9( 158)
  AUU 31.1(2532)   ACU 22.4(1820)   AAU 25.1(2038)   AGU 12.5(1020)
AUC 19.4(1580)   ACC 14.5(1175)   AAC 26.7(2168)   AGC  7.6( 621)
AUA 11.1( 906)   ACA 13.8(1118)   AAA 29.9(2433)   AGA 20.1(1634)
  AUG 18.7(1517)   ACG  6.0( 491)   AAG 33.8(2748)   AGG  6.6( 539)
  GUU 26.9(2188)   GCU 28.9(2351)   GAU 35.7(2899)   GGU 25.5(2075)
  GUC 14.9(1210)   GCC 16.6(1348)   GAC 25.9(2103)   GGC  8.1( 655)
  GUA  9.9( 804)   GCA 15.1(1228)   GAA 37.4(3043)   GGA 19.1(1550)
  GUG 12.3( 998)   GCG  3.9( 314)   GAG 29.0(2360)   GGG  5.8( 468)
  外源基因的长度直接影响到转化的转化的效率，当外源基因大于1000 bp时，转化率大于50%；当外源基因小于500 bp时，转化率会减小到0.1%[11]。
　　基因剂量，即外源表达盒(cas-settes)在宿主染色体上整合的拷贝数，对于外源蛋白的表达量影响很大一般情况下，外源基因整合的拷贝数愈高，蛋白表达量愈大，Friedrich等表达鼠表皮生长因子时多拷贝产生非常高的外源蛋白表达量[12]。但是并非所有高拷贝的转化子都能产生高的表达量，辛利等在用巴斯德毕赤酵母表达人血管抑素时发现，拷贝数超过1的菌株表达血管抑素的量要高于单拷贝的菌株，然而拷贝数超过2以后，重组蛋白的表达量并没有明显的增长[13]。高拷贝数不能高表达的可能原因是外源mRNA的翻译效率低或蛋白通过内质网不能正确折叠引起的。
  5分泌型外源蛋白的修饰
　　巴斯德毕赤酵母能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰，包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、脂类添加、O-连接和N-连接糖基化等[14，15]。由于许多天然哺乳动物的蛋白质都有糖基化，所以为了保证重组蛋白的生物活性，放生正确的糖基化是非常必要的。毕赤酵母的O-糖基化是在高尔基复合体里发生的，它在外源蛋白的丝氨酸或苏氨酸的羟基上添加寡聚糖。添加的寡聚糖只含甘露糖，而哺乳动物细胞所添加的寡糖链含N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸[16]。N-糖基化作用从内质网开始,在高尔基复合体中进一步加工修饰[17]。当外源蛋白质中含有一致性序列Asn-Xaa-Thr/Ser时，毕赤酵母能在其中天门冬氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化[18]。
　　糖基化对外源蛋白表达的影响因蛋白的种类不同而不同，有些外源蛋白经糖基化后表达量明显升高，有些则会降低，有些对表达量无明显的影响，目前对其机理尚不明确。糖基化对外源蛋白功能的影响也是因蛋白不同而有所差异，可能增强、减弱或对表达蛋白的功能无明显影响，这可能是因糖基化位点所处的部位造成的。
  6巴斯德毕赤酵母表达系统的应用与展望
　　自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原至今已有近千种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中获得表达[19]，主要用于人类药物的生产。其中分泌表达的硫代羟腈裂合酶已达到l4-8 g/L的高产率,鼠明胶蛋白达到14.8 g/L，组织坏死因子产量高达6 g/L；而胞内表达的巴西三叶胶腈水解酶产量高达22 g/L，破伤风片段C产量高达12 g/L，羟腈裂合酶达到了22 g/L的高产率。巴斯德毕赤酵母表达系统是用来表达复杂真核蛋白的一类较为理想的表达系统，在基因工程产品产业化生产中具有很好的商业前景。
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